Trong hệ thống phát hiện của máy phân tích axit amin, dẫn xuất sau cột là một bước quan trọng trong việc chuyển đổi các axit amin được tách ra bởi các cột sắc ký thành các dẫn xuất có thể được phát hiện với độ nhạy cao, trong khi phát hiện huỳnh quang là phương tiện cốt lõi để đạt được phân tích định lượng axit amin bằng cách bắt tín hiệu huỳnh quang của các dẫn xuất. Hai kết hợp có thể giải quyết vấn đề "tín hiệu huỳnh quang yếu của axit amin tự do, khó phát hiện độ nhạy cao trực tiếp", là sự kết hợp công nghệ chính của phân tích axit amin hiện đại (đặc biệt là phân tích dấu vết), nguyên tắc của nó có thể được chia thành hai phần "cơ chế phản ứng có nguồn gốc sau cột" và "nguyên tắc quang học phát hiện huỳnh quang", cụ thể như sau:
I. Nguyên tắc có nguồn gốc sau cột: chuyển đổi "axit amin khó phát hiện" thành "dẫn xuất dễ phát hiện".
Bản thân các phân tử axit amin (ngoại trừ tryptophan) thiếu sự hấp thụ tia cực tím mạnh hoặc các nhóm phát xạ huỳnh quang và có độ nhạy cực thấp khi phát hiện trực tiếp (không thể đáp ứng nhu cầu phân tích vi lượng μg/L). Logic cốt lõi có nguồn gốc sau cột là: cho phép các axit amin sau khi tách khỏi cột sắc ký trao đổi ion (chế độ tách thường được sử dụng để phân tích axit amin), phản ứng hóa học với một "thuốc thử dẫn xuất" cụ thể sau khi chảy ra cột để tạo ra các dẫn xuất ổn định với huỳnh quang mạnh (hoặc hấp thụ tia cực tím mạnh) để tạo điều kiện cho các phát hiện độ nhạy cao tiếp theo.
1. Quy trình cốt lõi: Tách → Trộn → Phản ứng → Phát hiện
Hệ thống dẫn xuất sau cột bao gồm "bể chứa thuốc thử có nguồn gốc, máy trộn, cuộn phản ứng, thiết bị kiểm soát nhiệt độ". Các bước cụ thể là:
Tách axit amin: nhiều loại axit amin trong mẫu được tách ra bởi cột trao đổi ion (chẳng hạn như nhựa trao đổi cation sulfonic), chảy ra từ cột theo thứ tự cụ thể do sự khác biệt về ái lực của các axit amin khác nhau với nhựa;
Trộn thuốc thử: Dòng axit amin sau khi tách (pha chảy+axit amin) được trộn đầy đủ với dòng thuốc thử có nguồn gốc (ví dụ: naphthylone, phthalaldehyde OPA, 9-naphthylmethylchloroformate FMOC) thông qua "T-Mixer";
Phản ứng nhiệt độ không đổi: chất lỏng hỗn hợp đi vào "cuộn phản ứng kiểm soát nhiệt độ" (thường là 30-130 ℃, tùy thuộc vào tác nhân), phản ứng phái sinh xảy ra ở nhiệt độ cụ thể để tạo ra các dẫn xuất huỳnh quang;
Phát hiện nhập cảnh: Các dẫn xuất sau phản ứng chảy trực tiếp vào máy dò huỳnh quang để bắt tín hiệu.
II. Nguyên tắc phát hiện huỳnh quang: bắt tín hiệu huỳnh quang của các dẫn xuất, nhận ra phân tích định lượng
Phát hiện huỳnh quang dựa trên hiện tượng "quang phát quang": khi một dẫn xuất huỳnh quang được chiếu sáng bởi một bước sóng ánh sáng cụ thể (ánh sáng kích thích), năng lượng hấp thụ electron trong phân tử chuyển sang mức năng lượng cao, sau đó giải phóng một phần năng lượng thông qua một bước nhảy không bức xạ, sau đó chuyển trở lại trạng thái cơ bản và phát ra một bước sóng ánh sáng cụ thể (huỳnh quang). Máy dò huỳnh quang chuyển cường độ huỳnh quang thành tín hiệu điện bằng cách "kích thích lọc ánh sáng, thu huỳnh quang, chuyển đổi tín hiệu", cuối cùng nhận ra phân tích định lượng axit amin.
1. Cấu trúc cốt lõi và quy trình làm việc của máy dò huỳnh quang
Máy dò huỳnh quang chủ yếu bao gồm "nguồn sáng, đơn sắc kích thích, hồ mẫu, đơn sắc phát xạ, ống nhân quang (PMT), bộ xử lý tín hiệu", các bước cụ thể như sau:
Sản xuất ánh sáng kích thích: ánh sáng hợp chất phát ra từ nguồn sáng (thường được sử dụng đèn xenon, có thể cung cấp phổ liên tục 200-800nm), được lọc bởi "bộ đơn sắc kích thích" (bao gồm các lưới và khe), chỉ giữ lại ánh sáng đơn sắc phù hợp với các dẫn xuất "bước sóng kích thích" (chẳng hạn như các dẫn xuất OPA tương ứng với ánh sáng kích thích 340nm);
Kích thích và phát xạ huỳnh quang: ánh sáng kích thích đi qua bể mẫu (chảy qua một giải pháp dẫn xuất có nguồn gốc sau cột), huỳnh quang phát ra sau khi các phân tử dẫn xuất hấp thụ năng lượng (hướng huỳnh quang vuông góc với ánh sáng kích thích để tránh nhiễu ánh sáng kích thích);
Lọc và thu gom huỳnh quang: huỳnh quang phát ra được lọc bằng "đơn sắc phát xạ" (loại bỏ nhiễu loạn và ánh sáng kích thích không được hấp thụ), chỉ giữ lại ánh sáng đơn sắc phù hợp với "bước sóng phát xạ" của các dẫn xuất (ví dụ như các dẫn xuất OPA tương ứng với ánh sáng phát xạ 450nm);
Chuyển đổi tín hiệu và định lượng: huỳnh quang được lọc được nhận bởi "ống nhân quang điện (PMT)", PMT chuyển đổi tín hiệu ánh sáng yếu thành tín hiệu điện tỷ lệ (hiện tại hoặc điện áp), sau đó khuếch đại bộ xử lý tín hiệu, chuyển đổi mô đun, tạo ra màu sắc quang phổ "cường độ huỳnh quang - thời gian lưu giữ";
Cơ sở định lượng: Theo "dạng huỳnh quang mở rộng của định luật Lambert-Beer" - trong một phạm vi nồng độ nhất định, cường độ huỳnh quang của các dẫn xuất huỳnh quang tỷ lệ thuận với nồng độ axit amin, nồng độ của mỗi axit amin trong mẫu có thể được tính toán bằng cách so sánh "cường độ huỳnh quang của các dẫn xuất axit amin tiêu chuẩn (đường cong chuẩn)" với "cường độ huỳnh quang của các dẫn xuất mẫu".
2. Lợi thế cốt lõi của phát hiện huỳnh quang: độ nhạy cao và độ đặc hiệu cao
So với phát hiện hấp thụ UV, phát hiện huỳnh quang trong phân tích axit amin có lợi thế không thể thay thế, đây cũng là lý do cốt lõi tại sao các nguồn gốc sau cột thường được kết hợp với phát hiện huỳnh quang:
Độ nhạy cao: giới hạn phát hiện (LOD) của phát hiện huỳnh quang có thể đạt đến mức nmol/L hoặc thậm chí pmol/L (1-3 bậc cường độ thấp hơn so với phát hiện UV) và có thể phát hiện dấu vết của các axit amin trong các mẫu sinh học (ví dụ: máu, nước tiểu) (ví dụ: tăng dấu vết của các axit amin do chuyển hóa bất thường);
Độ đặc hiệu cao: chỉ có thể phát hiện "các dẫn xuất có thể tạo ra huỳnh quang", trong khi các pha dòng chảy, tạp chất (nếu không phản ứng với các tác nhân có nguồn gốc) hầu như không có tín hiệu huỳnh quang, có hiệu quả có thể tránh nhiễu loạn (chẳng hạn như phân tích axit amin sau khi thủy phân protein trong thực phẩm, không cần xử lý trước phức tạp để khử nhiễu);
Phạm vi tuyến tính rộng: Trong phạm vi nồng độ 10⁴-10⁵, cường độ huỳnh quang có mối quan hệ tuyến tính tốt với nồng độ axit amin, thích hợp cho việc định lượng các mẫu có hàm lượng khác nhau (từ dấu vết đến hằng số).
B5-03=giá trị thông số Ki, (cài 3)
Sự kết hợp của cả hai giải quyết hoàn hảo các điểm đau "tách-phát hiện" của xét nghiệm axit amin, tạo thành một vòng kín:
Có nguồn gốc sau khi tách, tránh nhiễu: có nguồn gốc sau cột được thực hiện sau khi tách axit amin qua cột sắc ký, thuốc thử có nguồn gốc sẽ không phản ứng với các tạp chất trong mẫu (ví dụ: protein, muối) (các tạp chất đã được tách ra bởi cột sắc ký hoặc không có nhóm amin), tránh "sự tách biệt ảnh hưởng của các tạp chất có nguồn gốc" (dẫn xuất trước cột có thể chồng chéo các đỉnh do sự đồng tẩy rửa của các dẫn xuất với các tạp chất);
huỳnh quang sau có nguồn gốc, tăng độ nhạy: bằng cách chuyển đổi "axit amin không huỳnh quang" thành "dẫn xuất huỳnh quang mạnh", cho phép phát hiện huỳnh quang bắt được tín hiệu yếu và đáp ứng nhu cầu phân tích dấu vết (chẳng hạn như phát hiện chính xác phổ chuyển hóa axit amin trong chẩn đoán lâm sàng);
Tín hiệu được liên kết với nồng độ để đạt được định lượng: cường độ huỳnh quang tỷ lệ thuận với nồng độ dẫn xuất (tức là nồng độ axit amin ban đầu), kết hợp với đường cong tiêu chuẩn có thể định lượng chính xác từng hàm lượng axit amin, kết quả lặp lại tốt (RSD thường<2%).