1- Tên đề tài: Giải pháp nâng cao hiệu quả đầu tư phát triển kết cấu hạ tầng thương mại (

Là một hệ thống biểu hiện nhân chuẩn hiệu quả cao, hệ thống biểu hiện nấm men Pichia có nhiều ứng dụng và lợi thế đáng kể. So với các hệ thống biểu hiện khác, lợi thế của hệ thống biểu hiện nấm men Tất Xích rất rõ ràng. Nó có một trong những chất khởi động mạnh mẽ và nghiêm ngặt hiện nay - chất khởi động AOX1 của gen aloxidase, làm cho việc điều chỉnh biểu hiện của gen ngoại sinh chính xác và hiệu quả hơn. Trình độ biểu hiện cao, vừa có thể thực hiện biểu hiện trong bào, vừa có thể tiến hành biểu hiện loại tiết, đáp ứng rất lớn nhu cầu nghiên cứu và sản xuất khác nhau. Quá trình lên men trưởng thành và dễ phóng đại, đã có khả năng sản xuất mật độ cao công nghiệp hóa quy mô lớn, tạo điều kiện thuận lợi cho sự phát triển công nghiệp hóa. Chi phí nuôi cấy thấp, sản phẩm dễ tách, môi trường lên men được sử dụng rẻ tiền và không chứa protein, có lợi cho việc tách và tinh chế các sản phẩm hạ nguồn, giảm chi phí sản xuất. Gen protein ngoại sinh ổn định di truyền, sau khi tích hợp vào nhiễm sắc thể của nấm men Tất Xích, có thể tồn tại ổn định với sự sao chép của nhiễm sắc thể, không dễ bị mất. Ngoài ra, là một hệ thống biểu hiện eukaryote, Bichasia cũng có cấu trúc tế bào của eukaryote, có khả năng thực hiện quá trình biến đổi sau dịch thuật như glycosyl hóa, axit béo hóa, phosphoryl hóa protein và các protein biểu hiện khác, cho phép các protein biểu hiện gần gũi hơn về cấu trúc và chức năng với protein tự nhiên và có hoạt tính sinh học cao hơn.

II. Hệ thống biểu hiện nấm men Bikini

1, Vật chủ

Các vi khuẩn chủ hiện đang được sử dụng để biểu hiện protein ngoại sinh là Mut+methanol GS115, X-33, SMD1165, SMD1163 và SMD1168. MutS methanol sử dụng KM71 chậm; Mut-methanol loại không sử dụng MC100-3. Xem chi tiết bảng dưới đây, liệt kê chi tiết các đặc điểm biểu hiện khác nhau của nấm Tất Xích.

B5-05=giá trị thông số Kd, (cài 2)

Chủng	đặc điểm
GS115	Với mức độ biểu hiện cao, mật độ tế bào cao, sản xuất protein hòa tan cao, vi khuẩn chủ hiện đang được sử dụng rộng rãi
KM71	Methanol sử dụng loại chậm, thích hợp để biểu hiện các protein khó hòa tan
X33	Có thể làm tăng khối lượng biểu hiện và hoạt động, thích hợp để biểu hiện protein tái tổ hợp
Sản phẩm SMD1168H	Hiệu quả biểu hiện tốt hơn và mật độ tế bào cao hơn, thích hợp để biểu hiện các protein phân tử lớn
SMD116 (hi4 pep4)	Thuộc chủng Protein missing, có khả năng làm giảm sự suy thoái protein và giải quyết vấn đề phân phối không đồng đều các sản phẩm biểu hiện do sự suy thoái protein, mặc dù chủng này phát triển tương đối chậm và có thể dẫn đến sản xuất protein ngoại sinh thấp hơn.
Số Y-11430	Khả năng biểu đạt hiệu quả và biểu hiện có thể điều chỉnh

2, tàu sân bay

Phương tiện truyền dẫn biểu đạt men Tất Xích chủ yếu là phương tiện truyền dẫn tập hợp, phương tiện truyền dẫn thường gặp có thể chia thành phương tiện truyền dẫn biểu đạt trong bào và phương tiện truyền dẫn biểu đạt tiết ra.

B5-05=giá trị thông số Kd, (cài 2)

III. Quy trình lên men men Bicha

1, Giai đoạn lên men của nấm men Pichia

Quá trình lên men của nấm Tất Xích thường chia làm hai giai đoạn: 1, giai đoạn tăng trưởng tế bào: đầu tiên trong môi trường có nguồn gốc carbon là glycerin hoặc glucose, tích lũy đủ mật độ tế bào và sinh khối, khi nồng độ nấm đạt đến một giai đoạn nhất định, khi glycerin hoặc glucose cạn kiệt, sẽ dẫn đến giá trị oxy hòa tan đột nhiên tăng lên khoảng 100%, sau đó bắt đầu chảy thêm dung dịch glycerin hoặc glucose, và duy trì lượng không khí và tốc độ khuấy động, để duy trì mức độ oxy hòa tan khoảng 30%, tăng thêm sinh khối (nồng độ nấm). 2, giai đoạn cảm ứng: Khi sinh khối đạt yêu cầu, ngừng bổ sung nguồn carbon, cạn kiệt nguồn carbon, sau khi kết thúc giai đoạn chuyển tiếp, chuyển nguồn carbon sang methanol để cảm ứng biểu hiện giai đoạn lên men của protein mục tiêu. Thông thường, liên tục thêm 0,3% methanol hai lần cảm ứng, sau đó bắt đầu chảy methanol cảm ứng protein biểu hiện, cách này có thể làm tăng mức độ biểu hiện protein bên ngoài, và cho phép nấm Bichasia tích lũy nồng độ protein mục tiêu cao trong một thời gian ngắn.

Giai đoạn biểu hiện cảm ứng là một liên kết quan trọng trong quá trình sản xuất lên men của nấm Bicha, trong đó methanol được sử dụng như một chất cảm ứng cụ thể để thay thế các nguồn carbon trước đó. Các gen alcoxidase trong nấm Bichain, chẳng hạn như AOX1, được kích hoạt với sự hiện diện của methanol, thúc đẩy sự biểu hiện hiệu quả của các gen ngoại sinh. Kiểm soát có điều kiện trong giai đoạn này có ảnh hưởng quan trọng đến sản xuất và chất lượng protein ngoại sinh, đòi hỏi phải kiểm soát chặt chẽ các thông số như lượng methanol được bổ sung, tốc độ bổ sung và nhiệt độ, pH và lượng oxy hòa tan trong môi trường lên men để đảm bảo rằng các gen ngoại sinh có thể được biểu hiện liên tục và hiệu quả trong khi tránh độc tính của methanol đối với tế bào cũng như các tác dụng phụ khác.

2. Các loại và công thức của môi trường lên men

Các loại cơ sở bồi dưỡng lên men men Tất Xích đa dạng, các công thức bồi dưỡng khác nhau thích hợp cho các giai đoạn và mục đích lên men khác nhau.

Môi trường BSM (muối cơ bản) là một trong những môi trường cơ bản thường được sử dụng trong quá trình lên men nấm Bichasia, với công thức điển hình: 85% phosphate 26,7ml/l, canxi sulfat dihydrate 0,93g/l, kali sulfat 18,2g/l, magiê sulfat heptahydrate 14,9g/l, kali hydroxit 4,13g/l, glycerol 40,0g/l, PTM1 4,35ml/l. Môi trường này có thể cung cấp các thành phần dinh dưỡng thiết yếu cho sự phát triển của nấm Bichasia, bao gồm nguồn nitơ, nguồn phốt pho, nguồn kali, muối vô cơ như nguồn magiê và glycerin làm nguồn carbon, trong khi PTM1 bổ sung các chất dinh dưỡng như vi lượng và vitamin cần thiết cho sự phát triển của nấm men, giúp duy trì sự tăng trưởng và trao đổi chất bình thường của các tế bào nấm men.

Môi trường F22 cũng là một môi trường lên men phổ biến của nấm Bichasia, có công thức có thể được điều chỉnh cho các ứng dụng nghiên cứu và sản xuất khác nhau, nhưng thường chứa một lượng vừa phải các nguồn carbon (như glucose hoặc glycerin), các nguồn nitơ (như chiết xuất nấm men, protein terpene, v.v.), các muối vô cơ (như magiê sulfate, canxi clorua, kali dihydrogen phosphate, v.v.) và các chất phụ gia khác (như biotin, dung dịch nguyên tố vi lượng, v.v.). So với môi trường BSM, môi trường F22 có thể được tối ưu hóa về thành phần và tỷ lệ thành phần dinh dưỡng để đáp ứng các nhu cầu lên men cụ thể, chẳng hạn như trong một số trường hợp có thể có lợi hơn cho việc tăng lượng protein ngoại sinh hoặc cải thiện chất lượng protein.

Ngoài hai phương tiện phổ biến được đề cập ở trên, còn có nhiều phương tiện lên men men Bicha khác, thường được tối ưu hóa và điều chỉnh theo mục đích thí nghiệm cụ thể, đặc điểm chủng và yêu cầu của quá trình lên men. Ví dụ, trong một số nghiên cứu, để cải thiện hiệu quả sử dụng của nấm Bicha đối với các chất nền cụ thể hoặc tăng cường khả năng chịu đựng áp lực môi trường, một số thành phần đặc biệt như axit amin, axit hữu cơ, polysaccharide, v.v. được thêm vào môi trường; Hoặc tối ưu hóa con đường tăng trưởng và trao đổi chất của các tế bào nấm men bằng cách điều chỉnh tỷ lệ các nguồn carbon, nitơ và muối vô cơ trong môi trường để đạt được hiệu quả lên men và sản xuất sản phẩm cao hơn.

3. Thông số quá trình lên men

Kiểm soát chính xác các thông số quá trình lên men đóng một vai trò quan trọng trong sự thành công của quá trình lên men, bao gồm pH, nhiệt độ, oxy hòa tan, v.v., chúng liên quan và ảnh hưởng lẫn nhau, cùng nhau xác định tình trạng tăng trưởng, hoạt động trao đổi chất, cũng như mức độ biểu hiện protein bên ngoài của nấm men.

Độ pH: là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến quá trình lên men của nấm Bichasia. Các yêu cầu về độ pH khác nhau đối với men Bi Xích trong các giai đoạn tăng trưởng và quá trình trao đổi chất khác nhau. Trong giai đoạn tăng trưởng tế bào, phạm vi pH thích hợp nói chung là 5,0-6,0, trong điều kiện pH này, tế bào nấm men có thể duy trì trạng thái tăng trưởng tốt, hoạt động của enzyme cũng có thể được phát huy tốt hơn, có lợi cho sự tăng sinh của tế bào và tích lũy các chất trao đổi chất. Giá trị pH trong quá trình lên men của nấm Bichasia không chỉ ảnh hưởng đến trạng thái phát triển của nấm mà còn ảnh hưởng quan trọng đến sự biểu hiện của protein bên ngoài. Tác động của pH đối với nấm Bichasia chủ yếu bao gồm các khía cạnh sau: (1) ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme nội bào, do đó ảnh hưởng đến sự trao đổi chất của tế bào, do đó, sự biểu hiện của protein ngoại sinh cũng bị ảnh hưởng; (2) ảnh hưởng đến tính thấm của màng tế bào, có tác động nhất định đến việc tế bào hấp thụ chất dinh dưỡng và bài tiết các sản phẩm trao đổi chất; (3) Giá trị pH có thể ảnh hưởng đến sự phân ly các thành phần trong môi trường nuôi cấy và các chất chuyển hóa của tế bào, do đó ảnh hưởng đến sự hấp thụ chất dinh dưỡng của tế bào; (4) giá trị pH cũng có thể ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất của tế bào, làm cho nội dung của các chất trao đổi chất của tế bào thay đổi, trong quá trình lên men mật độ cao, để giảm protein ngoại sinh bị suy thoái protease, bạn nên tránh giá trị pH tối ưu của hành động protease, đặt giá trị pH ngoài protein và các điểm điện khác, cũng sẽ cải thiện tỷ lệ thu hoạch protein ngoại sinh.

Nhiệt độ: Nó cũng có tác động đáng kể đến sự tăng trưởng và trao đổi chất của nấm Bicha. Nhiệt độ sinh trưởng của men Bi Xích thường thích hợp trong khoảng 28 - 30 độ C. Trong phạm vi nhiệt độ này, các tế bào nấm men phát triển nhanh hơn và hoạt động trao đổi chất mạnh mẽ, cho phép tăng trưởng và nhân lên hiệu quả bằng cách sử dụng các chất dinh dưỡng trong môi trường nuôi cấy. Tuy nhiên, nếu nhiệt độ quá cao, vượt quá 32 ° C, có thể dẫn đến chết tế bào, vì nhiệt độ cao có thể phá hủy cấu trúc màng tế bào, sự ổn định của các đại phân tử sinh học như protein và axit nucleic, do đó ảnh hưởng đến chức năng sinh lý bình thường của tế bào. Ngược lại, ở nhiệt độ thấp hơn, trong khi tốc độ tăng trưởng của tế bào có thể chậm lại, một số nghiên cứu đã chỉ ra rằng việc giảm nhiệt độ nuôi cấy thích hợp có thể cải thiện sản xuất và chất lượng protein mục tiêu. Điều này là do nhiệt độ thấp có thể làm giảm ứng suất gấp protein trong tế bào và giảm sự xuất hiện của gấp sai, đồng thời cũng làm giảm hoạt động của protease và giảm mức độ thủy phân của protein ngoại sinh, do đó có lợi cho việc gấp và tích lũy protein ngoại sinh.

Oxy hòa tan (DO): là một thông số quá trình quan trọng khác trong quá trình lên men của nấm Bichasia. Saccharomyces bicaeus đòi hỏi sự tham gia của oxy khi sử dụng glycerin và methanol để phát triển và trao đổi chất, vì vậy duy trì mức độ oxy hòa tan thích hợp là rất quan trọng để đảm bảo quá trình lên men diễn ra suôn sẻ. Nồng độ oxy hòa tan thường cần được duy trì ở mức>20% trong suốt quá trình lên men. Nhu cầu oxy tương đối thấp trong giai đoạn đầu phát triển của tế bào do số lượng vi khuẩn nhỏ, khi nhu cầu oxy hòa tan của tế bào có thể được đáp ứng bằng cách thở và khuấy thích hợp. Khi các tế bào phát triển và tăng cường hoạt động trao đổi chất, việc tiêu thụ oxy tăng dần, tại thời điểm này cần điều chỉnh thêm thông khí, tốc độ khuấy hoặc bổ sung oxy tinh khiết để tăng mức độ hòa tan để đảm bảo rằng các tế bào có thể nhận đủ oxy để trao đổi chất. Nếu không có đủ oxy hòa tan, nó có thể dẫn đến sự tăng trưởng chậm của tế bào, giảm sự tích tụ các chất trao đổi chất và thậm chí dẫn đến cái chết của tế bào, ảnh hưởng nghiêm trọng đến hiệu quả của quá trình lên men và sản xuất các sản phẩm.

Thời gian nuôi cấy: Đây là một trong những yếu tố quan trọng nhất để đạt được mức độ biểu hiện protein cao nhất trong hệ thống biểu hiện nấm Bichasia, nơi thời gian sản xuất tương đối dài (khoảng 100 giờ). Thời gian nuôi cấy có liên quan đến số lượng tế bào nấm men và mức độ suy thoái của protein mục tiêu, với các nghiên cứu cho thấy mật độ tăng trưởng cao nhất của tế bào nấm men Pasterbi là 96h, trong khi biểu hiện protein cao nhất xảy ra ở 48h, cho thấy thời gian nuôi cấy dài hơn có thể dẫn đến sự tiêu hóa của protein biểu hiện bằng thủy phân, cũng có những nghiên cứu khác cho thấy thời gian biểu hiện protein tối ưu xảy ra ở 72~96 h. [1]

Quá trình lên men nấm Bicha là một quá trình phức tạp và tinh tế đòi hỏi sự kiểm soát và tối ưu hóa chính xác các giai đoạn lên men, công thức nuôi cấy và các thông số quá trình, và các điều kiện lên men như pH, nhiệt độ, oxy hòa tan và thành phần nuôi cấy có thể được tối ưu hóa một cách có hệ thống thông qua phương pháp thiết kế thực nghiệm (DOE) để phát huy đầy đủ lợi thế của nấm Bicha và đạt được sự biểu hiện và sản xuất protein ngoại sinh hiệu quả. Thông qua sự hiểu biết sâu sắc về đặc tính và nhu cầu lên men của nấm Bicha, kết hợp với công nghệ và thiết bị lên men tiên tiến và liên tục tối ưu hóa quá trình lên men, nó hứa hẹn sẽ cải thiện hơn nữa hiệu quả và chất lượng sản phẩm của quá trình lên men Bicha.

B5-05=giá trị thông số Kd, (cài 2)

Trong quá trình lên men của nấm Bicha, máy lên men đóng vai trò là thiết bị cốt lõi, cung cấp các điều kiện môi trường quan trọng cho sự phát triển và trao đổi chất của nấm Bicha, đảm bảo rằng nó có thể biểu hiện protein ngoại sinh một cách hiệu quả.

Máy lên men cung cấp nhiệt độ tăng trưởng thích hợp cho nấm men Bicha thông qua một hệ thống kiểm soát nhiệt độ chính xác. Như đã đề cập trước đó, trong giai đoạn tăng trưởng 28-30 ° C và các yêu cầu cụ thể về nhiệt độ trong giai đoạn biểu hiện cảm ứng, hệ thống kiểm soát nhiệt độ của máy lên men có thể được duy trì chính xác trong các phạm vi nhiệt độ thiết lập này, tránh ảnh hưởng bất lợi của nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp đối với sự phát triển của tế bào nấm men và biểu hiện protein. Việc kiểm soát nhiệt độ chính xác này đặc biệt quan trọng trong sản xuất lên men quy mô lớn, đảm bảo rằng mỗi lô nấm men Bicha phát triển trong môi trường nhiệt độ ổn định và phù hợp, do đó cải thiện sự ổn định và lặp lại của sản xuất.

Để điều chỉnh độ pH, máy lên men được trang bị thiết bị phát hiện và điều chỉnh pH tiên tiến. Trong các giai đoạn khác nhau của quá trình lên men men Bichasia, tùy thuộc vào sự thay đổi nhu cầu về độ pH, máy lên men có thể tự động thêm dung dịch axit và kiềm để duy trì độ pH chính xác trong phạm vi mong muốn. Duy trì pH 5.0-6.0 trong giai đoạn tăng trưởng tế bào và điều chỉnh đến 3.0-5.0 trong giai đoạn biểu hiện cảm ứng, kiểm soát pH chính xác này giúp duy trì hoạt động của enzyme nội bào nấm men, thúc đẩy sự tăng trưởng và trao đổi chất bình thường của tế bào, đồng thời giảm sự suy thoái của protein ngoại sinh và tăng sản lượng và chất lượng protein.

Kiểm soát nồng độ oxy hòa tan cũng là một trong những chức năng chính của máy lên men. Trong quá trình lên men, men Bi Xích có nhu cầu cao về oxy hòa tan. Máy lên men thông qua hệ thống thông khí hợp lý và thiết bị khuấy để đảm bảo nồng độ oxy hòa tan luôn được duy trì ở mức>20%. Hệ thống thông hơi có thể đi vào không khí hoặc oxy đồng đều vào chất lỏng lên men, trong khi thiết bị khuấy thông qua khuấy liên tục, để oxy phân tán đầy đủ trong chất lỏng lên men, nâng cao hiệu quả truyền oxy, đáp ứng nhu cầu oxy của nấm men Pichia trong các giai đoạn tăng trưởng khác nhau, đảm bảo tiến hành bình thường của hoạt động trao đổi chất, do đó thúc đẩy sự biểu hiện hiệu quả cao của protein bên ngoài.

Sự phối hợp của hệ thống khuấy và thông hơi cũng đảm bảo sự phân bố đồng đều các chất dinh dưỡng trong dung dịch lên men, tránh tình trạng thiếu dinh dưỡng cục bộ hoặc dư thừa, để mỗi tế bào nấm men Bikini có thể phát triển trong một môi trường dinh dưỡng tốt. Đồng thời, hiệu suất niêm phong của máy lên men cũng rất quan trọng, nó có thể ngăn ngừa ô nhiễm của các tạp chất bên ngoài, để đảm bảo tính tinh khiết và ổn định của quá trình lên men men Pichia, để tránh thất bại lên men do nhiễm khuẩn hoặc giảm chất lượng sản phẩm và các vấn đề khác.

Các sản phẩm lên men của Kamweisheng được thiết kế và sản xuất dựa trên chính xác những nhu cầu quan trọng này, với kiểm soát nhiệt độ tiên tiến, điều chỉnh pH, kiểm soát oxy hòa tan và hệ thống khuấy và thở hiệu quả cao, có thể cung cấp các điều kiện môi trường tối ưu cho quá trình lên men của nấm Bicha, giúp người dùng đạt được hiệu quả cao và ổn định trong quá trình lên men của nấm Bicha, cho dù trong giai đoạn thử nghiệm nhỏ trong phòng thí nghiệm hay sản xuất quy mô lớn trong công nghiệp, hiệu suất có thể được thực hiện để đáp ứng các nhu cầu khác nhau của người dùng đối với quá trình lên men Bicha và góp phần vào sự phát triển mạnh mẽ của ngành công nghiệp công nghệ sinh học. Chúng tôi sẽ tiếp tục quan tâm đến động lực nghiên cứu và nhu cầu ứng dụng của nấm men Bi Xích, không ngừng tối ưu hóa và đổi mới công nghệ thiết kế và sản xuất của máy lên men, nâng cao hiệu suất và tính ổn định của máy lên men, cung cấp hỗ trợ thiết bị tiên tiến và hiệu quả hơn cho sản xuất lên men của nấm men Bi Xích, cùng nhau thúc đẩy ngành công nghiệp công nghệ sinh học hướng tới tương lai rực rỡ hơn.

Giới thiệu máy lên men công nghiệp Kamweisheng
Jimway-be ® Lab Series ------ Lò phản ứng lớp Desktop

Jimway-be ® Dòng PM ------ lò phản ứng sinh học đa kết nối

Những dịp thích hợp: Nuôi cấy và lên men và biểu hiện của các tế bào prokaryote/eukaryote

Khối lượng đĩa petri: 250ml/500ml/1L/3L/5L/10L

Số lượng đơn vị: 2-16 liên kết

Phương pháp nuôi cấy: treo&dán tường

Loại mái chèo: Ba lá xiên, sáu lá xiên, sáu lá phẳng, nửa ống, nâng mái chèo và nhiều kết hợp khác

Phương pháp truyền: Ổ đĩa ghép nối từ/khuấy cơ học

Chiến lược điều khiển: PID&chiến lược điều khiển bậc thang (bổ sung, khuấy tốc độ, nhiệt độ, thông gió, vv)

Kiểm soát bổ sung: Kiểm soát bổ sung chính xác (lỗi ± 1g)

Tính năng chức năng:

Giao diện đơn giản: Nắm vững thao tác trong vài phút, làm ít công to

Không giám sát: có thể truy cập từ xa, hoạt động, nhận ra không giám sát

Chức năng công thức: công thức một phím xuống để giảm lỗi vận hành của nhân viên và nâng cao chất lượng

Phân tích dữ liệu: Thực hiện nhiều lô dữ liệu so sánh, cũng có thể thêm Doe&PAT để thực hiện phân tích đa biến sâu, tối ưu hóa dữ liệu quá trình

Chia sẻ dữ liệu: Xuất bản web dựa trên VPN cho phép giám sát và xem đường cong lịch sử trên thiết bị di động (Android, IOS, Windows) với bảo mật dữ liệu và bảo mật thiết bị được đảm bảo