Một,Ống ly tâm siêu lọcTối ưu hóa thông số ly tâm
RPM và thời gian
Đề xuất ly tâm ban đầu bắt đầu ở mức 70% tốc độ đề nghị (ví dụ: 3.000 × g ly tâm trong 10 phút) và điều chỉnh từng giai đoạn đến 4.000 × g sau khi quan sát tốc độ dòng chảy, nhưng không vượt quá giới hạn dung nạp của màng lọc.
Thời gian xử lý điển hình là 10-30 phút, tùy thuộc vào trọng lượng phân tử bị mắc kẹt (MWCO) và khối lượng mẫu.
Kiểm soát nhiệt độ
Máy ly tâm cần làm lạnh trước đến 4 độ C, giảm hấp phụ biến tính nhiệt. Môi trường nhiệt độ thấp có thể kéo dài tuổi thọ của màng, nhưng cần lưu ý rằng thời gian tập trung có thể kéo dài.
Tăng tốc và cân bằng
Gia tốc ly tâm được điều chỉnh đến mức thấp nhất, giảm áp lực lên màng.
Đảm bảo chất lượng ống siêu lọc được ghép nối cân bằng với trọng tâm. Vị trí và hướng của phần tử lọc phù hợp để tránh rung lắc hoặc hư hỏng trong quá trình ly tâm.
II. Chiến lược nâng cao tỷ lệ thu hồi
Lựa chọn phim lọc và tiền xử lý
Màng siêu lọc MWCO nhỏ hơn 2-3 lần so với phân tử mục tiêu được chọn dựa trên trọng lượng phân tử mục tiêu. Ví dụ, với trọng lượng phân tử protein mục tiêu là 35kDa, một ống siêu lọc có trọng lượng phân tử 10kDa được chọn.
Màng siêu lọc của ống ly tâm siêu lọc mới mua có chứa một lượng nhỏ glycerin, trước khi sử dụng cần ngâm bằng nước tinh khiết hoặc dung dịch đệm và đặt trong tủ lạnh 10 phút. Sau đó đổ nước tinh khiết ra, rồi đặt ống siêu lọc lên băng để nguội trước 2 - 5 phút.
Xử lý mẫu và thêm mẫu
Các mẫu được lọc trước bằng màng lọc 0,22μm để tránh các hạt làm tắc nghẽn màng siêu lọc.
Từ từ thêm mẫu vào ống siêu lọc, bề mặt chất lỏng không vượt quá vạch đánh dấu tối đa. Thao tác khi thêm mẫu phải nhẹ, tránh phá hoại kết cấu màng.
Tập trung và tẩy rửa
Tạm dừng mỗi 5 phút trong quá trình ly tâm, dùng súng di dịch nhẹ nhàng thổi lên lớp chặn, phòng ngừa đại phân tử chồng chất hình thành lớp cực hóa chênh lệch nồng độ.
Khối lượng bị mắc kẹt được kiểm soát từ 1/10 đến 1/20 kích thước mẫu ban đầu. Hệ số cô đặc quá cao dễ dẫn đến sự tích tụ protein, có thể được thêm vào giữa quá trình siêu lọc để thay thế, cô đặc theo từng giai đoạn.
Đối với các mẫu nhớt (như glycerin hoặc sucrose), cần giảm tốc độ quay 10% -20% và kéo dài thời gian ly tâm.
Hoạt động tái chế
Sau khi ly tâm, các phân tử lớn vẫn ở trên, các phân tử nhỏ và dung môi đi qua màng vào lớp dưới. Bộ lọc ống bên ngoài là các chất phân tử nhỏ và dung môi; Chất lỏng ống bên trong là chất đại phân tử.
Nếu cần thu thập vật liệu phân tử lớn, hãy lấy ống bên ngoài, ống bên trong được đặt ngược 1000 × g ly tâm trong 1-2 phút.
III. Các vấn đề và giải pháp thường gặp
Mất protein hoặc không phát hiện được protein
Lý do: lựa chọn màng lọc không đúng cách, thông số ly tâm không phù hợp, nồng độ ban đầu của mẫu quá thấp, v.v.
Giải pháp: Chọn lại màng lọc MWCO phù hợp, điều chỉnh các thông số ly tâm, đảm bảo nồng độ ban đầu của mẫu lớn hơn 25μg/ml.
Màng bị tắc hoặc tốc độ dòng chảy quá chậm
Lý do: quá nhiều hạt trong mẫu, ô nhiễm màng lọc, v.v.
Giải pháp: Lọc mẫu trước, rửa hoặc thay màng lọc thường xuyên. Khi phát hiện màng bị tắc, ngâm với 0,1M NaOH trong 1 giờ và rửa lại 3 lần bằng nước tinh khiết.
Tỷ lệ thu hồi thấp
Lý do: hấp thụ màng lọc, hoạt động không đúng cách, v.v.
Giải pháp: Đóng màng lọc 1% BSA trước 30 phút, giảm hấp phụ không đặc hiệu. Khi thao tác chú ý nhẹ nhàng, tránh phá hủy cấu trúc màng.
Sự lắng đọng sau khi siêu lọc
Lý do: Nồng độ protein quá cao, Buffer không phù hợp, v.v.
Giải pháp: siêu lọc đồng thời với nhiều ống siêu lọc, giảm nồng độ; Thay đổi các Buffer khác nhau cho đến khi protein không kết tủa. Để kết tủa, có thể ly tâm lại sau khi tan urê 8M.
IV. Bảo trì và bảo trì
Làm sạch&khử trùng
Ống ly tâm siêu lọc dùng một lần, được loại bỏ trực tiếp sau khi sử dụng.
Nếu cần tái sử dụng, sử dụng xong siêu lọc ống nước tinh khiết rửa 5 lần, lại dùng 0.1M NaOH ngâm 1-2 giờ, sau đó dùng 20% ethanol rửa, dùng nước siêu tinh khiết hoặc dung dịch đệm rửa 3 lần. Thông thường không nên sử dụng lại ống siêu lọc quá 5 lần.
Bảo quản lâu dài
Bảo quản ngắn hạn: ngâm với 0,1M NaOH trong 1-2 giờ, rửa 3 lần bằng nước tinh khiết, sau đó ngâm với 75% ethanol, hãy chắc chắn để giữ cho màng lọc ẩm và không bị nhiễm khuẩn.
Bảo quản lâu dài: ngâm với 0.1M NaOH trong 1-2 giờ, rửa 3 lần bằng nước tinh khiết, sau đó ngâm với 20% ethanol, hãy chắc chắn để giữ cho bộ phim ẩm và không có vi khuẩn.