Cột trao đổi cation hỗn hợp kết hợp chế độ giữ lại kép của trao đổi cation và sắc ký ngược, phương pháp hoạt động của nó cần phải tính đến các đặc tính của hai cơ chế, các bước cụ thể và các điểm chính như sau:
I. Chuẩn bị trước khi hoạt động
Chọn cột
Chọn cột hỗn hợp phù hợp dựa trên tính chất của hợp chất mục tiêu (ví dụ: giá trị pKa, phân cực). Ví dụ, các cột axit sulfonic có tính axit mạnh phù hợp với các hợp chất cơ bản của pKa2-10 (ví dụ: amin, sulfonamid).
Xác nhận sự ổn định của ma trận cột (như copolymer styrene-dievinyl benzene) và nhóm chức năng (như nhóm axit sulfonic) đảm bảo không bị phân hủy trong phạm vi pH0-14 và trong dung môi hữu cơ.
Kiểm tra thiết bị
Kiểm tra tốc độ dòng chảy, phạm vi áp suất của hệ thống sắc ký (ví dụ: HPLC) phù hợp với yêu cầu của cột (ví dụ: áp suất tối đa của cột thép không gỉ 4500psi, cột thủy tinh 3000psi).
Cột bảo vệ được lắp đặt để ngăn chặn cột phân tích bị ô nhiễm hoặc bị chặn.
Chuẩn bị thuốc thử
Công thức tẩy rửa (như dung dịch methanol axit, đệm axit citric) và khử khí, lọc (màng lọc 0,2-0,5 μm), tránh bong bóng và nhiễu hạt.
Chuẩn bị dung môi kích hoạt (ví dụ: methanol, nước) và dung dịch rửa (ví dụ: hỗn hợp có chứa dung môi hữu cơ và muối đệm).
II. Các bước hoạt động
Kích hoạt cột
Mục đích: loại bỏ các tạp chất, làm cho giai đoạn cố định đầy đủ hòa tan và đảm bảo hiệu quả cột.
Phương pháp:
Cột được kích hoạt lần lượt bằng methanol (gấp 3-5 lần thể tích giường cột, tốc độ dòng chảy 1-5 mL/phút) và nước (cùng thể tích và tốc độ dòng chảy).
Nếu cột không được sử dụng trong một thời gian dài, trước tiên cần rửa sạch bằng nhiều nước, sau đó rửa sạch bằng methanol và cuối cùng bảo quản trong dung dịch nước chứa 50% methanol.
Mẫu trên mẫu
Mục đích: Kết hợp các vật thể mục tiêu với sự cố định, và các tạp chất chảy ra với dòng chảy.
Phương pháp:
Dung dịch mẫu được chuyển từ từ qua cột với tốc độ dòng chảy 0,5-2 mL/phút, đảm bảo tiếp xúc đồng đều với pha cố định.
Nếu nồng độ mẫu quá cao, cần pha loãng để tránh vượt quá khả năng chịu tải của cột.
Rửa sạch
Mục đích: Loại bỏ các tạp chất có tính chất khác với vật mục tiêu nhưng được hấp thụ trên cột.
Phương pháp:
Chọn dung môi máy và muối đệm (ví dụ: dung dịch nước methanol 5%) với liều lượng 3-5 lần thể tích giường cột, tốc độ dòng chảy 1-3 mL/phút.
Tránh cho vật mục tiêu bị tẩy sạch, cần tối ưu hóa chủng loại và tỷ lệ tẩy rửa.
Mục tiêu rửa
Mục đích: Phá vỡ sự tương tác của vật thể mục tiêu với pha cố định và thu thập chất tẩy rửa.
Phương pháp:
Hỗn hợp dung dịch có nồng độ axit/kiềm cao với dung môi hữu cơ (ví dụ: dung dịch methanol axit) được chọn làm chất tẩy rửa với liều lượng 2-4 lần thể tích giường cột, tốc độ dòng chảy 1-3 mL/phút.
Thu thập chất tẩy rửa để tránh mất mục tiêu do tẩy rửa quá mức.
Tái tạo và bảo quản cột
Mục đích: khôi phục trạng thái ban đầu của cột và kéo dài tuổi thọ.
Phương pháp:
Trước tiên rửa sạch cột bằng nhiều nước, sau đó rửa sạch bằng methanol, cuối cùng bảo quản trong dung dịch nước chứa 50% methanol, sau khi niêm phong được đặt ở nhiệt độ thích hợp.
Nếu cột bị ô nhiễm, bạn có thể rửa bằng dung dịch đặc biệt như 1MNH₄ NO₃ hoặc rượu isopropyl.
III. Lưu ý chính
Kiểm soát tốc độ dòng chảy
Tránh tốc độ dòng chảy quá nhanh dẫn đến giảm hiệu quả cột hoặc mất pha cố định, tốc độ dòng chảy quá chậm sẽ kéo dài thời gian phân tích.
Khi điều chỉnh tốc độ lưu thông cần thay đổi từng bước, phòng ngừa quấy nhiễu giường bổ sung.
pH và giới hạn nhiệt độ
Tránh làm hỏng các cột ma trận silicone bằng cách sử dụng độ pH cực cao (chẳng hạn như dung môi kiềm có độ pH>6,5 hoặc dung môi axit có độ pH<2,5).
Nên sử dụng cột ở nhiệt độ phòng dưới 40 ℃, nhiệt độ cao có thể làm giảm sự ổn định.
Lựa chọn tẩy rửa
Tránh sử dụng các chất đệm có chứa các sản phẩm phân hủy như axit salicylic để không làm thay đổi tính chất pha cố định.
Chất tẩy rửa cần được pha chế tươi để tránh ô nhiễm vi sinh vật hoặc thay đổi cường độ ion ảnh hưởng đến hiệu quả tách.
Tiền xử lý mẫu
Lọc mẫu để loại bỏ tạp chất hạt và ngăn chặn chặn các bài viết bị chặn.
Nếu sự khác biệt về tính phân cực giữa mẫu và dòng chảy lớn, cần pha pha lê hoặc pha lệt.
IV. Áp dụng ví dụ cảnh
Kiểm tra an toàn thực phẩm: Khi phát hiện melamine (hợp chất kiềm) trong sữa, sử dụng cột đảo ngược trao đổi cation yếu hỗn hợp để đạt được sự tách biệt hiệu quả thông qua chế độ kép trao đổi cation và giữ lại pha.
Phân tích thuốc: Khi phân tích thuốc kiềm và các chất chuyển hóa của chúng trong máu, cơ chế giữ lại kép của cột phản xạ trao đổi cation mạnh hỗn hợp được sử dụng để cải thiện hiệu quả tách và độ nhạy.
Giám sát môi trường: Việc rửa nhanh và phân tích định lượng các chất mục tiêu đạt được bằng cách tối ưu hóa các điều kiện rửa khi phát hiện các chất gây ô nhiễm kiềm trong nước, chẳng hạn như các hợp chất amin.