Hệ thống hình ảnh gel thông qua hình ảnh quang học kết hợp với phân tích phần mềm, có thể đạt được phân tích định lượng và nồng độ chính xác của trọng lượng phân tử, các quy trình cốt lõi và các điểm kỹ thuật như sau:
Nguyên tắc và bước định lượng chính xác trọng lượng phân tử
Xây dựng đường cong chuẩn
Hệ thống sử dụng dải DNAMarker có trọng lượng phân tử đã biết làm tham chiếu để đánh dấu vị trí của nó thông qua phần mềm và tạo ra một đường cong phù hợp với khoảng cách di chuyển trọng lượng phân tử. Đường cong này dựa trên mối quan hệ tuyến tính giữa trọng lượng phân tử và độ di chuyển trong điện di, đảm bảo tính chính xác của việc tính toán trọng lượng phân tử của dải chưa biết. Ví dụ, khi trọng lượng phân tử của dải Marker trên phim DNA (ví dụ: 100bp, 500bp, 1000bp) được dán nhãn, hệ thống sẽ tự động phù hợp với đường cong để tính toán trọng lượng phân tử của dải không xác định tiếp theo.
Tính toán trọng lượng phân tử dải không xác định
Gel sau khi điện di của mẫu được thử nghiệm được đặt trong hệ thống hình ảnh, kích thích huỳnh quang (như nhuộm EB) thông qua các nguồn ánh sáng cực tím hoặc nhìn thấy, và sau khi phần mềm chụp hình ảnh, trọng lượng phân tử của nó được tính toán kết hợp với đường cong tiêu chuẩn dựa trên vị trí di chuyển của dải không xác định trong gel. Phương pháp này chính xác hơn so với ước tính bằng mắt thường và sai số có thể được kiểm soát trong vòng ± 5%.
II. Phương pháp định lượng chính xác nồng độ
Đánh dấu mật độ và tương phản
Hệ thống bắt đầu bằng cách đánh dấu một dải tiêu chuẩn có nồng độ đã biết (chẳng hạn như hàm lượng DNA của một dải trên phim DNA), sau đó nhấp vào dải không xác định bằng phần mềm để so sánh sự khác biệt về mật độ của nó với dải tiêu chuẩn và tính toán nồng độ mẫu không xác định. Ví dụ, nếu mật độ dải tiêu chuẩn là 100 đơn vị, nồng độ tương ứng là 50 ng/μL và mật độ dải không xác định là 50 đơn vị, thì nồng độ của nó là khoảng 25 ng/μL.
Mối quan hệ tuyến tính mật độ quang
Lượng ánh sáng hấp thụ từ mẫu có mối quan hệ tuyến tính với nồng độ hoặc khối lượng. Hệ thống tính toán nồng độ mẫu không xác định bằng cách đo mật độ ánh sáng của dải (giá trị thang xám hoặc cường độ huỳnh quang), kết hợp với đường cong tiêu chuẩn hoặc dữ liệu mẫu đã biết. Phương pháp này phù hợp để xác định nồng độ của DNA, RNA và gel protein như keo PAGE.
III. Bảo đảm kỹ thuật chính
Tối ưu hóa hệ thống quang học
Sử dụng nguồn ánh sáng truyền UV hoặc nguồn ánh sáng truyền trắng để đảm bảo phân phối ánh sáng đồng đều và giảm ảnh hưởng của mật độ ánh sáng không đồng đều đến kết quả. CCD độ phân giải cao hoặc máy ảnh kỹ thuật số chụp hình ảnh, kết hợp với thiết kế hộp tối để che chắn nhiễu nguồn sáng bên ngoài, nâng cao chất lượng hình ảnh.
Chức năng phân tích phần mềm
Phần mềm hỗ trợ khấu trừ nền, phân chia dải, quét mật độ và các hoạt động khác, có thể tạo biểu đồ đường cong quét dọc và tích hợp để đạt được định lượng chính xác. Ví dụ, trong định lượng PCR, phần mềm có thể tính toán tỷ lệ phần trăm tương đối của mỗi dải và quét mật độ tạo ra đường cong phân phối dọc của giá trị thang màu xám của dải.
IV. Ứng dụng kịch bản và lợi thế
Nghiên cứu sinh học phân tử: xác định chính xác trọng lượng và nồng độ phân tử DNA/RNA, hỗ trợ nhân bản gen, xác minh trình tự.
Kỹ thuật protein: tỷ lệ sản phẩm biểu hiện protein phân tích định lượng, tối ưu hóa quá trình lên men.
Phát triển thuốc: Đánh giá độ tinh khiết của thuốc bằng cách xác định nồng độ, đảm bảo kiểm soát chất lượng.
Hệ thống này đạt được định lượng chính xác gấp đôi trọng lượng phân tử và nồng độ thông qua các quy trình chuẩn hóa và công nghệ tiên tiến, cung cấp hỗ trợ dữ liệu đáng tin cậy cho nghiên cứu khoa học đời sống.