Các xét nghiệm protein trên các máy phân tích định lượng axit nucleic siêu vi, chẳng hạn như máy đo protein nucleic siêu vi, chủ yếu dựa trên quang phổ UV-Visible, ước tính nồng độ của protein bằng cách đo độ hấp thụ của nó ở bước sóng cụ thể, chẳng hạn như 280nm. Dưới đây là các phương pháp cụ thể và các bước chính để kiểm tra protein:
I. Nguyên tắc kiểm tra
Các dư lượng tryptophan (Trp), tyrosine (Tyr) và liên kết Cys-Cys-disulfide trong phân tử protein được hấp thụ đáng kể ở bước sóng 280nm. Thiết bị tính toán trực tiếp nồng độ protein (mg/ml) bằng cách đo độ hấp thụ của dung dịch protein (A280) ở 280nm, kết hợp với định luật Lambert-Beer. Phương pháp này không yêu cầu xây dựng đường cong tiêu chuẩn, nhưng đảm bảo mẫu không chứa các tạp chất khác được hấp thụ mạnh ở 280nm (ví dụ: axit nucleic, phenolic).
II. Các bước hoạt động
Chuẩn bị dụng cụ
Kết nối nguồn điện, khởi động dụng cụ, làm nóng trước 5-10 phút đến trạng thái ổn định.
Chọn chế độ phát hiện "Protein A280" và thiết lập phạm vi ánh sáng (thường là 10 mm, nhưng thiết bị có thể tự động điều chỉnh).
Hiệu chuẩn điểm không sử dụng nước cất có độ tinh khiết cao hoặc bộ đệm trống để loại bỏ nhiễu nền.
Xử lý mẫu
Kích thước mẫu: Nên sử dụng mẫu 2μL (một số thiết bị hỗ trợ phát hiện dấu vết 0,5-2μL) để đảm bảo hình thành cột chất lỏng ổn định.
Tránh bong bóng: Chạm nhẹ vào đáy lỗ phát hiện khi lấy mẫu, giải phóng chất lỏng từ từ, ngăn bong bóng ảnh hưởng đến phép đo hấp thụ.
Sức căng bề mặt: Nếu sức căng bề mặt mẫu thấp (chẳng hạn như bao gồm chất khử nhiễm), có thể tăng kích thước mẫu lên 4 μL để đảm bảo sự ổn định của cột chất lỏng.
Kiểm soát trống
Ghi lại độ hấp thụ nền bằng cách lấy dung dịch trống 2μL, chẳng hạn như bộ đệm, thêm vào đế dưới, đặt đế trên xuống và nhấn nút "trống".
Lau đế để đảm bảo không có chất lỏng còn sót lại.
Kiểm tra mẫu
Lấy mẫu 2μL để thử và thêm vào đế dưới, đặt đế trên xuống và nhấn nút "Mẫu".
Dụng cụ tự động đo độ hấp thụ và tính toán nồng độ, kết quả thường được hiển thị trong mg/ml.
Mẫu nồng độ cao: Nếu giá trị hấp thụ vượt quá phạm vi thiết bị (ví dụ cường độ ánh sáng<200), cần pha loãng mẫu để kiểm tra lại.
Ghi dữ liệu và dọn dẹp
Lưu kết quả phát hiện và xuất sang định dạng CSV hoặc PDF.
Lau đế bằng vải không bụi để tránh ô nhiễm chéo.
III. Lưu ý chính
Hiệu chuẩn đường cơ sở
Bước sóng hiệu chuẩn cơ sở mặc định là 340nm và người dùng có thể điều chỉnh theo nhu cầu.
Hiệu chuẩn phải được thực hiện trước khi mẫu được phát hiện, nếu không giá trị quang phổ sẽ bị lệch, dẫn đến tính toán nồng độ sai.
Độ tinh khiết mẫu
Tránh các mẫu chứa axit nucleic, phenol hoặc nồng độ cao của các ion muối có thể tạo ra sự hấp thụ nhiễu ở 280nm.
Để phát hiện các mẫu chứa tạp chất, bạn có thể khấu trừ nền bằng cách kết hợp các phép đo màu (như BCA, Bradford) hoặc sử dụng bước sóng kép (280nm/340nm).
Bảo trì dụng cụ
Nguồn sáng: Tránh phơi sáng lâu và tắt nguồn sáng khi không sử dụng để kéo dài tuổi thọ.
Monochromator: Thường xuyên thay đổi chất hút ẩm (như silicone) để ngăn chặn các yếu tố phân tán bị ẩm và nấm mốc.
Máy dò: Ngăn chặn ánh sáng mạnh trực tiếp hoặc ẩm tích tụ bụi, giữ sạch sẽ.
Môi trường: Thiết bị nên được đặt trên bàn làm việc khô, ổn định, cách xa cửa thoát khí của điều hòa không khí hoặc ánh sáng mặt trời trực tiếp, nhiệt độ được kiểm soát ở 25 ℃ ± 2 ℃.
Xử lý mẫu đặc biệt
Mẫu ngưng tụ: tải chậm với tường nghiêng 45 độ để tránh tràn hoặc nhiễu vòng Newton.
Chất đa đường: Sau khi kiểm tra cần dùng thuốc thử cồn để rửa đường, tránh dư lượng.
Mẫu dầu mỡ: Nếu hiện tượng nổi xảy ra, cần tách ly tâm nhiệt độ thấp trước khi phát hiện.
IV. Ứng dụng kịch bản và lợi thế
Định lượng nhanh: Không cần xử lý trước phức tạp, hoàn thành phát hiện trong 2-5 phút, phù hợp với sàng lọc thông lượng cao.
Xét nghiệm vi lượng: Chỉ cần mẫu 0,5-2μL, tiết kiệm các mẫu quý (ví dụ: mẫu lâm sàng, protein hiếm).
Phân tích đa thông số: Một số thiết bị hỗ trợ phát hiện đồng thời A260 (axit nucleic), A280 (protein) và OD600 (nồng độ vi khuẩn), để đạt được định lượng đa thành phần.
Tính di động: Thiết kế nhỏ gọn để phát hiện hiện trường hoặc phòng thí nghiệm di động.