[Phương pháp xử lý PCR]

—— ——

PCR (phản ứng chuỗi polymerase) và điện di gel là các kỹ thuật thường được sử dụng trong nghiên cứu sinh học phân tử và chúng thường được kết hợp để xác định và phân tích các sản phẩm khuếch đại PCR. Tuy nhiên, khi thực hiện điện di gel PCR, các dải tạp chất thường được tìm thấy trong bản đồ điện di có thể can thiệp vào kết quả thí nghiệm và thậm chí dẫn đến thất bại thí nghiệm.

Bài viết này sẽ khám phá nguồn gốc của các tạp chất trong quá trình điện di của gel PCR và cung cấp một số giải pháp có thể.

●●●

Tối ưu hóa điều kiện PCR:Điều chỉnh điều kiện phản ứng PCR, nhiệt độ ủ quá thấp có thể dẫn đến sự kết hợp không cụ thể của mồi với khuôn, do đó kích hoạt sự khuếch đại không cụ thể; Nhiệt độ ủ quá cao có thể ức chế sự kết hợp bình thường của mồi và khuôn mẫu, ảnh hưởng đến hiệu quả khuếch đại. Nhiệt độ ủ tối ưu có thể được xác định từng bước bằng thí nghiệm PCR gradient Nói chung, nhiệt độ của bước ủ cho phản ứng PCR thường dao động từ 50 ° C đến 68 ° C, tùy thuộc vào trình tự cơ bản của mồi và các đặc tính của DNA mục tiêu. Một số mồi yêu cầu nhiệt độ ủ cao hơn để đảm bảo liên kết cụ thể trong một khu vực cụ thể, nhưng nói chung, nhiệt độ ủ tối đa không vượt quá 68 ° C.

●●●

Thiết kế mồi không hợp lý:Nếu độ dài mồi quá ngắn, lặp lại trình tự hoặc chứa các khu vực GC cao, nó có thể dẫn đến sự kết hợp không cụ thể của mồi với mẫu, do đó tạo ra các tạp chất. Các mồi cần được thiết kế lại để đảm bảo chúng có độ dài phù hợp, trình tự không lặp lại, hàm lượng GC vừa phải và tránh các khu vực GC cao bên trong mồi hoặc trong khu vực mà mồi kết hợp với khuôn mẫu.

●●●

Sử dụng mồi không đúng cách:Việc sử dụng quá nhiều mồi hoặc không đặc hiệu có thể dẫn đến sự khuếch đại không đặc hiệu, dẫn đến sự lộn xộn. Nên thay đổi mồi hoặc giảm lượng mồi được sử dụng.

●●●

Mẫu không thuần khiết:DNA khuôn mẫu chứa các tạp chất, chẳng hạn như protein, RNA hoặc các đoạn DNA không mục tiêu khác, có thể đóng vai trò là khuôn mẫu để khuếch đại PCR, dẫn đến sự xuất hiện của các dải bổ sung.

●●●

Phân hủy mẫu:DNA khuôn mẫu bị phân hủy trong quá trình chiết xuất hoặc lưu trữ, và các mảnh DNA nhỏ được tạo ra có thể trở thành khuôn mẫu cho sự khuếch đại không đặc hiệu.

●●●

DNA mẫu tinh khiết:DNA mẫu trong thí nghiệm PCR có thể đến từ nhiều nguồn, bao gồm DNA bộ gen (gDNA), DNA bổ sung (cDNA) và DNA plasmid. Tuy nhiên, DNA từ các nguồn khác nhau có thể khác nhau về thành phần và độ phức tạp, ảnh hưởng đến số lượng tối ưu để bắt đầu khuếch đại PCR. Ví dụ, trong phản ứng PCR 50 µL, plasmid DNA chỉ cần 0,1–1 ng, trong khi gDNA cần 5–50 ng. Ngoài ra, loại DNA polymerase được sử dụng cũng có ảnh hưởng đến số lượng mẫu tối ưu bắt đầu. DNA polymerase được biến đổi có ái lực mạnh hơn với khuôn mẫu và độ nhạy cao hơn, do đó cần tương đối ít DNA để bắt đầu. Tối ưu hóa số lượng DNA bắt đầu là rất quan trọng, vì số lượng quá cao có thể dẫn đến tăng nguy cơ khuếch đại không cụ thể, trong khi số lượng quá thấp có thể làm giảm tỷ lệ PCR. Đôi khi, sơ đồ PCR sử dụng số bản sao để biểu thị số lượng DNA bắt đầu, đặc biệt là đối với gDNA. Việc tính toán số bản sao liên quan đến hằng số Avogadro và khối lượng mol, với công thức cụ thể: số bản sao=L × mol=L × (tổng khối lượng/khối lượng mol).

●●●

Nồng độ Mg²⁺ quá cao:Mg²⁺ là một thành phần quan trọng trong phản ứng PCR, nhưng nồng độ quá cao có thể làm giảm tính đặc hiệu của sự khuếch đại PCR và làm tăng nguy cơ khuếch đại không đặc hiệu. Nồng độ Mg² tối ưu cần được xác định bằng thực nghiệm.

●●●

Liều lượng hoặc chất lượng kém của enzyme:Lượng enzyme quá cao hoặc chất lượng enzyme không tốt có thể ảnh hưởng đến phản ứng PCR. Nên giảm lượng enzyme hoặc thay thế enzyme từ nguồn khác.

●●●

Sử dụng nhiệt để khởi động PCR:PCR khởi động nhiệt có thể làm giảm sự khuếch đại không cụ thể mà phản ứng có thể gây ra ở nhiệt độ thấp.

PCR khởi động nhiệt là một kỹ thuật được sử dụng để giảm khuếch đại không cụ thể. Trong PCR thông thường, mồi có thể đã gắn vào DNA mẫu khi nhiệt độ phản ứng tăng lên trước khi nhiệt độ khuếch đại. Điều này có thể dẫn đến sự khuếch đại không đặc hiệu xảy ra ngay từ đầu PCR, tạo ra kết quả dị ứng hoặc dương tính giả. PCR khởi động nhiệt giải quyết vấn đề này bằng cách thêm một polymerase DNA ổn định vào phản ứng PCR.

Chìa khóa để bắt đầu PCR nhiệt là sử dụng một polymerase đòi hỏi sự kích hoạt nhiệt độ cao. Enzyme này chỉ hoạt động ở nhiệt độ cao hơn và do đó bắt đầu khuếch đại trình tự DNA mục tiêu khi bắt đầu phản ứng, thay vì kích hoạt phản ứng không đặc hiệu ở nhiệt độ thấp.

Một số polymerase khởi động nhiệt thường được sử dụng bao gồm các phiên bản sửa đổi của Taq polymerase ổn định nhiệt, chẳng hạn như Taq DNA polymerase với miền kích hoạt nhiệt và polymerase có độ trung thực cao như Pfu hoặc Phusion.

Vì vậy, các enzyme ngày nay về cơ bản đáp ứng các điều kiện.

●●●

Kiểm tra môi trường phòng thí nghiệm:Tránh ô nhiễm DNA và ô nhiễm dụng cụ thí nghiệm, sử dụng công nghệ vô trùng và thuốc thử được xử lý để giữ cho phòng thí nghiệm sạch sẽ.

●●●

Tối ưu hóa gradient PCR:Phản ứng PCR được thực hiện bằng cách sử dụng gradient nhiệt độ, tìm kiếm nhiệt độ khuếch đại cụ thể.

Công nghệ Baiheng Thông minh 2D Gradient PCR MeterĐộ biến đổi gradient nhiệt độ có thể được tối ưu hóa đồng thời trong cùng một phản ứng và độ biến đổi gradient nhiệt độ có thể được đặt theo chiều ngang 8 hàng gradient biến tính có thể được đặt theo chiều dọc 12 cột nhiệt độ ủ để tối ưu hóa nhiệt độ ủ tối ưu, do đó cải thiện tính đặc hiệu và hiệu quả của phản ứng PCR.

Kỹ thuật này rất hữu ích để tối ưu hóa các điều kiện mồi, mẫu và PCR để đảm bảo các sản phẩm PCR chất lượng cao và đặc hiệu có sẵn.

Các phương pháp này có thể được sử dụng riêng lẻ hoặc kết hợp để giúp giảm hoặc loại bỏ các vấn đề về băng tần PCR.