I. Trước khi sử dụng: làm tiền xử lý, bảo vệ cột sắc ký từ nguồn

Cột kích hoạt và cân bằng: Cột mới hoặc cột sắc ký không sử dụng trong hơn 1 tuần, trước khi sử dụng cần cân bằng pha chảy trong 30-60 phút (tốc độ dòng chảy 1,0mL/phút), đảm bảo pha cố định thấm đầy đủ; Cột phản pha (như C18) có thể được rửa sạch bằng methanol/nước (90: 10) trước khi chuyển sang pha chảy mẫu để tránh suy giảm hiệu suất do khô pha cố định. Nếu dung môi bảo quản trong cột không tương thích với pha chảy (ví dụ: cột pha tích cực được bảo quản bằng n-hexane và pha chảy bằng methanol), cần phải rửa sạch bằng gradient dung môi chuyển tiếp để ngăn dung môi hòa tan lẫn nhau tạo ra bong bóng hoặc sụp đổ pha cố định.

Làm sạch pha mẫu và dòng chảy: mẫu phải được lọc bằng màng lọc 0,22 μm, loại bỏ các hạt, vật chất lơ lửng và tránh chặn tấm sàng cột; Các mẫu có chứa tạp chất sôi cao, protein và dầu cần được làm sạch trước bằng cách chiết pha rắn (SPE) và các phương pháp khác để ngăn tạp chất hấp phụ vào pha cố định. Giai đoạn dòng chảy đòi hỏi siêu âm khử khí trong 15-20 phút, loại bỏ bong bóng (bong bóng có thể gây ra biến động áp suất cột, bất thường hình chóp); Khi sử dụng pha lưu lượng muối đệm, cần phải sử dụng nước có độ tinh khiết cao (chẳng hạn như nước siêu tinh khiết), sau khi lọc được sử dụng hiện tại, tránh kết tinh muối làm tắc nghẽn cột sắc ký.

Kiểm tra trạng thái dụng cụ: trước khi cài đặt cột sắc ký, làm sạch ống lót miệng mẫu, thay thế miếng đệm lão hóa, tránh mảnh vụn miếng đệm, dư lượng mẫu vào cột; Kiểm tra đường ống cho rò rỉ, tắc nghẽn, đảm bảo áp suất ổn định trước cột; Xác nhận rằng khớp cột được niêm phong tốt, chọn miếng than chì phù hợp để tránh tổn thương cột do rò rỉ khí mang hoặc áp suất không đồng đều.

II. Trong sử dụng: đặc điểm kỹ thuật hoạt động, tránh thiệt hại cột

Kiểm soát nhiệt độ và áp suất: tuân thủ nghiêm ngặt nhiệt độ sử dụng tối đa của cột sắc ký (cột phản chiếu thường ≤60 ℃, cột pha tích cực ≤80 ℃), tránh mất pha cố định tăng tốc ở nhiệt độ cao; Áp lực cột cần được kiểm soát trong phạm vi đề nghị của nhà máy (thường ≤40MPa), nếu áp suất đột ngột tăng hơn 30%, cần dừng kiểm tra ngay lập tức (như pha dòng chảy lọc, cổng mẫu làm sạch), tránh áp lực quá cao dẫn đến nén pha cố định, sụp đổ giường cột. Tốc độ tăng nhiệt đề nghị ≤10 ℃/phút, tránh nhiệt độ tăng và giảm phá hủy cấu trúc cột.

Đặc điểm kỹ thuật sử dụng pha chảy: Tránh sử dụng dung môi ăn mòn mạnh (ví dụ: axit clohydric đậm đặc, natri hydroxit), cột phản xạ Phạm vi pH pha chảy cần được kiểm soát ở mức 2-8 (ngoại trừ cột chống axit và kiềm đặc biệt), ngoài phạm vi có thể dẫn đến sự hòa tan của ma trận silicone, thủy phân pha cố định. Khi rửa gradient, thay đổi tỷ lệ pha hữu cơ không nên quá nhanh (chẳng hạn như thay đổi ≤10% mỗi phút), tránh co rút mạnh hoặc mở rộng pha cố định; Sau khi sử dụng pha lưu động có chứa muối đệm, cần kịp thời rửa sạch pha nước tỷ lệ cao, phòng ngừa kết tinh muối.

Yêu cầu vận hành mẫu: lượng mẫu cần phù hợp với dung lượng cột (lượng mẫu cột C18 thông thường ≤20 μL), tránh quá tải dẫn đến đuôi núi, ô nhiễm pha cố định; Nhiệt độ cổng mẫu được thiết lập hợp lý, cao hơn điểm sôi tối đa của mẫu 10-20 ℃, nhưng không vượt quá nhiệt độ sử dụng tối đa của cột, ngăn ngừa sự phân hủy mẫu tạo ra cột sắc ký ô nhiễm tạp chất. Tránh lấy mẫu liên tục nồng độ cao, mẫu ô nhiễm cao, nên rửa 10-15 cột thể tích bằng pha dòng chảy trống sau mỗi lần lấy mẫu 10-20 mũi.

III. Sau khi sử dụng: làm sạch kịp thời để kéo dài tuổi thọ của cột

Quy trình làm sạch thông thường: Sau khi thí nghiệm kết thúc, các cột sắc ký được rửa sạch với gradient pha chảy để loại bỏ các mẫu và tạp chất còn lại. Cột pha ngược: 20 cột thể tích được rửa bằng methanol/nước (50: 50), 30 cột thể tích được rửa bằng methanol tinh khiết hoặc acetonitrile để loại bỏ tạp chất hấp phụ mạnh; Cột pha tích cực: 20 cột thể tích được rửa bằng n-hexane/isopropanol (90: 10) và được bảo quản bằng hexane nguyên chất. Nếu mẫu chứa protein, dầu và các tạp chất khó tẩy rửa khác, bạn có thể thêm 5-10% tetrahydrofuran (THF) vào quá trình làm sạch để tăng cường hiệu quả tẩy rửa, nhưng cần chú ý đến khả năng tương thích của THF với một số pha cố định.

Xử lý ô nhiễm đặc biệt: Nếu áp suất cột tăng lên, đuôi núi nghiêm trọng, có thể là ô nhiễm trong cột, có thể làm sạch sâu. Cột pha ngược: rửa sạch với gradient tuần tự của methanol → methanol/THF (80: 20) → methanol → acetonitrile, thể tích cột 20 mỗi bước; Cột pha tích cực: rửa bằng n-hexane → n-hexane/ethyl acetate (50: 50) → n-hexane. Cấm rửa các cột pha tích cực bằng dung môi phân cực mạnh như acetone, dichloromethane và tránh mất pha cố định.

Phương pháp bảo quản: bảo quản ngắn hạn (trong vòng 1 tháng): cột pha được bảo quản bằng methanol tinh khiết hoặc acetonitrile niêm phong, cột pha tích cực được bảo quản bằng n-hexane, đảm bảo không có bong bóng trong cột; Bảo quản lâu dài (hơn 1 tháng): Cột pha ngược được bảo quản bằng methanol/nước (90: 10), cột pha dương được bảo quản bằng n-hexane/isopropanol (95: 5), ngăn ngừa lão hóa khô ở pha cố định. Khi bảo quản cần niêm phong cả hai đầu của cột sắc ký, đặt ở nơi khô mát (nhiệt độ 5-30 ° C), tránh ánh sáng mặt trời trực tiếp.

Thông qua bảo trì thông số kỹ thuật trên, tuổi thọ của cột sắc ký lỏng hiệu quả cao có thể được kéo dài đến 1000-2000 lần phân tích, đồng thời đảm bảo độ chính xác và lặp lại của dữ liệu phát hiện và giảm chi phí sử dụng. Phương pháp bảo trì các loại cột sắc ký khác nhau (ví dụ: cột trao đổi ion, cột chiral) cần được điều chỉnh kết hợp với hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất, tập trung vào tính tương thích dòng chảy và đặc tính pha cố định.