Máy phân tích PCR định lượng huỳnh quang thực hiện định lượng chính xác của gen bằng cách theo dõi sự thay đổi tín hiệu huỳnh quang trong thời gian thực, kết hợp với giá trị Ct và phân tích đường cong tiêu chuẩn, nguyên tắc cốt lõi và các bước thực hiện như sau:
Nguyên tắc cốt lõi
Các nhóm huỳnh quang (chẳng hạn như thuốc nhuộm SYBRGreen hoặc đầu dò TaqMan) được thêm vào hệ thống phản ứng khuếch đại PCR để đồng bộ hóa cường độ tín hiệu huỳnh quang với lượng sản phẩm khuếch đại. Với mỗi chu kỳ PCR hoàn thành, thiết bị thu thập tín hiệu huỳnh quang một lần, tạo ra một đường cong khuếch đại. Xác định số chu kỳ (giá trị Ct) khi sản phẩm khuếch đại đạt đến ngưỡng bằng cách đặt ngưỡng huỳnh quang (thường là độ lệch chuẩn 10 lần so với tín hiệu cơ bản). Giá trị Ct tương quan nghịch với số lượng mẫu bắt đầu, nghĩa là càng nhiều mẫu bắt đầu, giá trị Ct càng nhỏ.
Các bước thực hiện
Xây dựng đường cong tiêu chuẩn: Pha loãng gradient bằng cách sử dụng nồng độ tiêu chuẩn đã biết, chẳng hạn như DNA plasmid tinh khiết hoặc RNA phiên mã in vitro, khuếch đại PCR bằng cách sử dụng các mẫu tiêu chuẩn ở nồng độ khác nhau. Vẽ đường cong tiêu chuẩn bằng logarit của số bản sao tiêu chuẩn và giá trị Ct là tọa độ dọc. Nồng độ mẫu và giá trị Ct thường thể hiện mối quan hệ tuyến tính tốt (hệ số tương quan R²>0,99) khi phạm vi nồng độ sản phẩm tiêu chuẩn nằm trong số bản sao 10²-10⁰, đảm bảo định lượng chính xác trong phạm vi này.
Phát hiện mẫu không xác định: Một mẫu không xác định được khuếch đại đồng bộ với sản phẩm tiêu chuẩn để tính toán số bản sao của gen mục tiêu trong mẫu dựa trên giá trị Ct của nó vào công thức đường cong tiêu chuẩn. Ví dụ, nếu công thức đường cong chuẩn là y=3,1372x+38,201 (y là giá trị Ct và x là logarit số bản sao), bạn có thể tính ngược số lượng mẫu ban đầu của mẫu.
Chỉnh sửa gen nội sâm (định lượng tương đối): Khi cần so sánh sự khác biệt về biểu hiện gen giữa các mẫu khác nhau, gen quản gia (ví dụ: GAPDH, beta-actin) được chọn làm nhân tố nội sâm, tiếp tục sử dụng phương pháp ΔΔCt để phân tích khối lượng biểu hiện tương đối, loại bỏ ảnh hưởng của sự khác biệt về kích thước mẫu và hiệu quả phản ứng bằng cách tính toán chênh lệch giá trị Ct (ΔCt) giữa gen mục tiêu và gen nội sâm.