Các vấn đề phổ biến có thể xảy ra với hệ thống xử lý miễn dịch blot protein hoàn toàn tự động trong các thí nghiệm chủ yếu bao gồm tín hiệu yếu hoặc không có tín hiệu, nền cao, hiện tượng đa băng, bất thường dải, v.v. Dưới đây là phân tích chi tiết về những vấn đề này:
Tín hiệu yếu hoặc không có tín hiệu
Kháng 1 và kháng 2 không phù hợp: Kháng 2 và kháng 1 giống nhau đối với vật chủ, ví dụ kháng 1 đến từ chuột, kháng 2 nên là kháng thể kháng chuột.
Không đủ nồng độ kháng thể: Sử dụng kháng thể nồng độ cao và kéo dài thời gian ủ trong điều kiện 4 ℃, chẳng hạn như ủ qua đêm.
Chất bịt kín phản ứng chéo với kháng thể: sử dụng chất khử nhiễm nhẹ như Twain-20 hoặc thay thế chất bịt kín (ví dụ: sữa bột tách kem, BSA, huyết thanh, gelatin).
Protein không xác định được loài được kiểm tra: tham khảo hướng dẫn, so sánh trình tự miễn dịch và trình tự protein, đảm bảo rằng các kháng thể và protein đích sẽ phản ứng và kiểm soát dương tính được thiết lập.
Thiếu mẫu protein: Mẫu protein trên mỗi đường bơi thường không vượt quá 20 μg, sử dụng chất ức chế protease và thiết lập kiểm soát dương tính.
Màng quay không đầy đủ: Sử dụng chất nhuộm có thể đảo ngược để phát hiện hiệu ứng màng quay và kiểm tra xem hoạt động của màng quay có chính xác hay không, chẳng hạn như màng PVDF cần được nhúng trước vào methanol và sau đó vào bộ đệm chuyển.
Một kháng thất bại: Sử dụng kháng thể tươi và tránh sử dụng lặp đi lặp lại dẫn đến giảm nồng độ hiệu quả.
Dianti bị ức chế bởi natri azide: Tránh sử dụng natri azide cùng với kháng thể đánh dấu HRP.
Phát hiện hết hạn bộ dụng cụ hoặc bất hoạt chất nền: Sử dụng chất nền tươi.
Background cao
Đóng cửa không được thực hiện cụ thể hoặc đóng cửa không đầy đủ: kéo dài thời gian đóng cửa, xem xét thay thế niêm phong thích hợp.
Nồng độ I hoặc II quá cao: pha loãng kháng thể đến nồng độ thích hợp hoặc kéo dài thời gian ủ với kháng thể pha loãng cao hơn.
Sự kết hợp hoặc phản ứng không đặc hiệu giữa kháng II và thuốc đóng: thiết lập kháng II (không thêm kháng 1).
Rửa không đầy đủ protein không liên kết: tăng số lần rửa.
Màng khô: Trong quá trình ủ để ngăn chặn màng trở nên khô, mỗi bước để đảm bảo rằng màng có đầy đủ chất lỏng phản ứng, có thể được đưa vào khuấy liên tục hoặc chấn động nhẹ nhàng để màng ngâm trong dung dịch.
Chọn phim không đúng cách: Màng cellulose nitrat (màng NC) thấp hơn nền màng PVDF, có thể chọn màng phù hợp theo nhu cầu thí nghiệm.
Hiện tượng Multiband
Các tế bào được truyền quá nhiều lần và các protein được biểu hiện khác nhau: các thí nghiệm song song có kiểm soát được thực hiện bằng cách sử dụng các dòng tế bào ban đầu chưa được truyền lại.
Các mẫu protein được biểu hiện trong cơ thể có nhiều dạng biến đổi: chẳng hạn như acetyl hóa, methyl hóa, alkyl hóa, phosphoryl hóa, glycosyl hóa, v.v., các tác nhân có thể được sử dụng để khử phosphoryl hóa mẫu, khử glycosyl hóa để chứng minh sự biến đổi sau khi dịch.
Phân hủy mẫu protein: Thêm đủ chất ức chế protease vào bộ đệm mẫu.
Phát hiện các protein mới chưa được báo cáo hoặc các protein có epitope tương tự và cấu trúc khác nhau trong cùng một họ protein: tham khảo các báo cáo tài liệu khác, hoặc tìm kiếm BLAST, sử dụng các chủng hoặc mô tế bào được khuyến nghị.
Nồng độ kháng thể quá cao: Giảm nồng độ kháng thể và/hoặc thời gian ủ.
Strip bất thường
Nền có các đốm trắng không đồng đều: có bong bóng trên màng hoặc phân bố kháng thể không đồng đều trên màng khi quay phim, bong bóng nên được loại bỏ càng nhiều càng tốt trong quá trình quay phim, và các kháng thể vẫn lắc khi ủ.
Nền có các đốm đen: các kháng thể liên kết với chất đóng và có thể lọc chất đóng.
Các dải màu trắng xuất hiện trên nền sâu: một hoặc hai kháng thể được thêm vào quá nhiều và nồng độ kháng thể nên được pha loãng.
Dải đích nhuộm quá thấp/quá cao, tách không triệt để: thay đổi tỷ lệ gel, keo nồng độ thấp cho protein có trọng lượng phân tử lớn và keo nồng độ cao cho protein có trọng lượng phân tử nhỏ.
Hiệu ứng "nụ cười" dải: Việc di chuyển quá nhanh hoặc nhiệt độ điện di quá cao làm thay đổi độ pH và tốc độ di chuyển, có thể làm giảm tốc độ di chuyển hoặc điện di nhiệt độ thấp (như được thực hiện trong kho lạnh hoặc băng).
Các dải không đồng đều xuất hiện khi lai protein tương tự: gel đông cứng quá nhanh khi chuẩn bị gel, dẫn đến tỷ lệ acrylamide không đồng đều trong đường bơi, có thể tham khảo công thức của gel, thêm một lượng vừa phải TEMED vào gel, thêm một lượng vừa phải 1% SDS (pha loãng nước) vào đầu gel khi đặt để ngăn gel khô.