Giới thiệu

Protein đóng một vai trò quan trọng trong hệ thống sinh học và tham gia vào các quá trình trao đổi chất khác nhau cần thiết cho cuộc sống. Do tầm quan trọng của chúng, chúng được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp như dược phẩm, nơi chúng góp phần phát triển thuốc (ví dụ như kháng sinh và dược phẩm sinh học), cũng như sản xuất thực phẩm, nơi chúng đóng vai trò là thành phần chính trong các chất bổ sung dinh dưỡng. Với mục đích sử dụng của chúng trong các ứng dụng liên quan đến sức khỏe, điều quan trọng là đạt được độ tinh khiết cao trong quá trình chiết xuất protein.

Trong số các phương pháp tinh chế có sẵn khác nhau, sắc ký thường được sử dụng vì hiệu quả của nó trong việc cô lập protein. Các kỹ thuật thường được sử dụng bao gồm trao đổi ion, tương tác kỵ nước, ái lực, phản pha và sắc ký lọc gel.Sắc ký ngược đã trở thành công cụ quan trọng nhất để phân lập polypeptide và protein nhỏ. Do khả năng phân lập vượt trội của nó, polypeptide thường có thể được phân lập ngay cả khi nó chỉ khác nhau một dư lượng axit amin.Ngoài ra, sắc ký ngược sử dụng hỗn hợp nước làm pha chảy, do đó phương pháp này tương thích với các mẫu chứa nước. Sắc ký ngược được sử dụng rộng rãi để điều tra việc loại bỏ các hợp chất không mong muốn trong việc phát hiện tạp chất trong các nghiên cứu hoặc thanh lọc quy mô lớn các loại thuốc điều trị. Vì sắc ký ngược sử dụng dung môi hữu cơ phân cực làm pha chảy, phương pháp này chỉ có thể được sử dụng cho các hợp chất có khả năng chịu được các điều kiện nghiêm ngặt.Loại sắc ký này thường được áp dụng cho các peptide và các protein nhỏ, ổn định,Những protein này tự gấp lại sau khi tinh chế.

Sắc ký ngược có thể được thực hiện như là phương pháp Flash hoặc sắc ký lỏng hiệu quả cao. Hai kỹ thuật này thường được sử dụng cho các mục đích khác nhau:Sắc ký Flash chủ yếu được sử dụng như một bước trước khi tinh chế để tinh chế một số lượng lớn các mẫu với độ phân giải đầy đủ, trong khi sắc ký lỏng hiệu quả cao nhằm đạt được độ phân giải cao nhất (độ tinh khiết) trong điều kiện tải lên thấp hơn.. Vì vậy, sự khác biệt giữa hai kỹ thuật là vật liệu được sử dụng để cố định pha (kích thước hạt khác nhau), kích thước của cột sắc ký (đường kính bên trong và chiều dài) và tốc độ dòng chảy của pha chảy.

Bảng 1: Sự khác biệt giữa sắc ký Flash và HPLC

Protein là các phân tử phức tạp sử dụng cấu trúc ba chiều cụ thể được xác định bởi sự tương tác giữa dư lượng axit amin và dung môi xung quanh. Cấu trúc gấp này xác định bán kính thủy động lực học của chúng và nó mô tả kích thước hiệu quả của chúng trong dung dịch nước.Trong sắc ký, khả năng của protein để thâm nhập vào lỗ chân lông pha cố định ảnh hưởng trực tiếp đến hiệu quả tách.Khẩu độ lớn hơn trong môi trường sắc ký cho phép truy cập tốt hơn vào pha cố định, cải thiện độ phân giải của sự tách protein. Kích thước hạt của một pha cố định cũng có thể ảnh hưởng đến cách protein tương tác với bề mặt. Các hạt nhỏ hơn cung cấp nhiều vị trí tương tác hơn, dẫn đến sự tách biệt rõ ràng hơn, trong khi các hạt lớn hơn hạn chế diện tích tiếp xúc và giảm độ phân giải.Tối ưu hóa lỗ chân lông và kích thước hạt là cần thiết để đạt được sự tinh khiết protein hiệu quả cao.

Hành vi của protein trong quá trình tách sắc ký phần lớn bị ảnh hưởng bởi điện tích của nó, tùy thuộc vào độ pH của dung môi. Để duy trì sự ổn định của protein, nó thường được tinh chế trong dung dịch đệm để duy trì cấu trúc tự nhiên của nó.Trong một số trường hợp, thay đổi độ pH là một chiến lược hiệu quả để thay đổi điện tích của protein và cải thiện hiệu quả tách.

Thiết bị thí nghiệm

Thuốc thử và vật liệu

Các bước thử nghiệm

Sắc ký của nghiên cứu này được tạo ra trong các điều kiện thí nghiệm sau:

Bảng 3. Gradient 1

Bảng 4. Gradient 2

Bảng 5. Gradient 3

Các thí nghiệm trước đây đã chỉ ra rằng việc tách protein tối ưu có thể đạt được bằng cách sử dụng cột PrepPure C18WP (300Å), 10μm làm pha cố định. Hình 1 là sắc ký của mẫu, sử dụng PrepPure C18WP (300Å), 10μm, dưới gradient của các tài liệu tham khảo tương tự (gradient 1: 30% -90%, hơn 10 phút). Không giống như các tài liệu tham khảo, theo thứ tự tẩy rửa, chỉ có các đỉnh sau được quan sát: protein giống nang trứng, hồng cầu nang trứng, lysozyme, transferrin nang trứng và albumin nang trứng. Những khác biệt này có thể là do sự khác biệt về chất lượng và nguồn gốc của trứng được sử dụng để chuẩn bị mẫu.

Để đạt được điều kiện phân lập, chúng tôi đã tiến hành nhiều thí nghiệm để tối ưu hóa độ phân giải của protein mục tiêu. Hình 2 cho thấy sắc ký của PrepPure C18WP (300Å), 10μm, thu được ở gradient 2: 10%, 20% và 30%, có lợi cho việc tách protein mục tiêu.

Tiếp theo, với......Sơ đồ 2Điều kiện thí nghiệm là tham khảo, nghiên cứu ảnh hưởng của khẩu độ và kích thước hạt.

Hình 3Đối vớiSơ đồ 2Sắc ký đồ trong cùng điều kiện, sử dụng C18 Non-WP (100Å) (PrepPure C18, 10μm) để nghiên cứu ảnh hưởng của khẩu độ. Trong khi tín hiệu UV cho thấy độ phân giải được cải thiện ở hai đỉnh đầu tiên so với C18WP, tín hiệu hấp thụ và ELSD thấp hơn cho thấy không có sự tách biệt hiệu quả nào xảy ra. Khẩu độ lớn (300 Å) của C18WP cho phép protein xâm nhập vào các hạt và tương tác hiệu quả với pha cố định. Ngược lại, PrepPure C18 (100Å), 10μm không thể đạt được sự tách biệt vì protein chỉ có thể tương tác với bề mặt bên ngoài của hạt. Sự tương tác hạn chế này làm giảm số bước cân bằng giữa hấp phụ và giải hấp, do đó ảnh hưởng đến hiệu quả tách.

Hình 4 và 5Nó cho thấy rằng trongHình 2 và Hình 3Trong cùng điều kiện (gradient 3), sử dụng các cột sắc ký Flash: FlashPure Select C18 (100Å), 30μm và EcoFlex C18 (100Å), 50μm sắc ký. Khi kích thước hạt lớn hơn 10μm, hiệu quả tách không rõ ràng. Việc giảm tương tác bề mặt tiếp tục hạn chế các bước cân bằng giữa hấp phụ và giải hấp, làm cho gradient này không đủ để tách hiệu quả. Do đó, tất cả các protein được rửa sạch đồng thời với gradient 10%. Ngoài ra, khi kích thước hạt tăng lên, nhiều protein được rửa sạch ở mức 10%, giảm 30% so với quan sát trước đó.

Kết luận

Tài liệu tham khảo