Máy quang phổ dừng dòng là một kỹ thuật phân tích được sử dụng để nghiên cứu động lực học của phản ứng nhanh, cốt lõi của nó nằm ở việc đạt được sự pha trộn nhanh chóng của các chất phản ứng với sự ngừng chảy tức thời và theo dõi quá trình phản ứng trong thời gian thực thông qua tín hiệu quang học. Dưới đây là một mô tả chi tiết về cách nó hoạt động và các chi tiết sử dụng:
I. Nguyên tắc làm việc
1. Hệ thống trộn nhanh: Đơn vị trộn của máy quang phổ dừng dòng thường được điều khiển bởi hai ống tiêm hoặc thiết bị khí nén, trộn hai chất phản ứng (như thuốc thử A và B) với tốc độ cao thông qua vòi phun hoặc buồng trộn. Thời gian trộn có thể ngắn tới 0,5 mili giây, đảm bảo phản ứng bắt đầu trong điều kiện đồng pha.
2. Hệ thống phát hiện quang học: dung dịch trộn chảy vào bể quan sát, hệ thống quang học ghi lại những thay đổi về độ hấp thụ, huỳnh quang hoặc tín hiệu tán xạ trong thời gian thực thông qua nguồn sáng (ánh sáng nhìn thấy hoặc tia cực tím), bộ đơn sắc (chọn bước sóng cụ thể) và máy dò (chẳng hạn như photodiode hoặc CCD). Độ phân giải thời gian có thể đạt đến cấp micro giây (10μs-10ms) để chụp trung gian thoáng qua hoặc động lực phản ứng nhanh.
3. Kiểm soát phân biệt thời gian: trộn đồng bộ với phát hiện quang học bằng kích hoạt, sau khi phản ứng ngừng dòng chảy, liên tục ghi lại đường cong thay đổi của tín hiệu theo thời gian, do đó dẫn đến hằng số tốc độ phản ứng, năng lượng kích hoạt và các thông số động lực khác.
II. Chi tiết sử dụng
1. Chuẩn bị mẫu: chất phản ứng cần được xây dựng trước trong bộ đệm thích hợp và lọc qua màng lọc 0,22 μm để tránh các hạt làm tắc vòi phun. Đối với các mẫu protein hoặc enzyme, cần làm lạnh trước đến 4 ° C để duy trì hoạt động.
2. Cài đặt tham số
- Tốc độ dòng chảy so với tỷ lệ trộn: Điều chỉnh tốc độ đẩy của ống tiêm (ví dụ: 18,5 μL/ms) theo tốc độ phản ứng để đảm bảo trộn đều.
- Lựa chọn bước sóng: Đặt bước sóng đặc trưng (chẳng hạn như đỉnh hấp thụ protein 280nm) thông qua bộ đơn sắc, với bước tối thiểu lên tới 0,1nm.
- Cửa sổ thời gian: Đặt chu kỳ phát hiện (chẳng hạn như bước mili giây đến giây) theo thời gian phản ứng dài, tránh bỏ lỡ tín hiệu trung gian quan trọng.
3. Thu thập dữ liệu: Sau khi kích hoạt hỗn hợp, hệ thống tự động ghi lại đường cong thay đổi độ hấp thụ hoặc cường độ huỳnh quang theo thời gian. Thử nghiệm lặp lại nhiều lần (thường ≥3 lần) là cần thiết để cải thiện tỷ lệ tín hiệu tiếng ồn và các đối chứng trống (như đường cơ sở đệm) được khấu trừ.
4. Bảo trì dụng cụ
- Quy trình làm sạch: Ngay sau khi thí nghiệm, đường ống được rửa sạch bằng nước khử ion, sau đó loại bỏ protein dư hoặc kết tủa khoáng chất bằng dung dịch axit nitric hoặc natri hydroxit nồng độ thấp.
- Hiệu chuẩn định kỳ: Kiểm tra cường độ nguồn sáng, độ nhạy của máy dò và tính nhất quán của thời gian trộn, đặc biệt là độ trễ thời gian đánh dấu lại sau khi sử dụng lâu dài.
- Chăm sóc bể mẫu: Bể quan sát (ví dụ như thể tích 20μL) cần được giữ sạch sẽ để tránh bong bóng hoặc vết trầy xước ảnh hưởng đến đường dẫn ánh sáng.
5. Thận trọng
- Tính đồng nhất trộn: Các mẫu phức tạp có thể dự đoán áp suất hoặc sử dụng buồng trộn xoáy để giảm gradient khuếch tán).
- Kiểm soát khối lượng chết: Thiết kế đường ống cần giảm thiểu khối lượng dư (thường<10μL) để tránh ô nhiễm chéo.
- Tác động nhiệt độ: Hệ thống điều khiển nhiệt độ cần duy trì nhiệt độ bể phản ứng không đổi (ví dụ: ± 0,1 ℃), tránh sóng nhiệt gây nhiễu tốc độ phản ứng.